Técnicas de observación en microscopia

La observación a campo claro es la técnica de microscopia más simple. En este sistema la luz pasa a través o es reflejada por la muestra, sin ninguna alteración, más allá de la que provoca la propia muestra.

Toda la luz desde el espécimen y alrededores es colectada por el objetivo para formar una imagen contra fondo totalmente brillante. Este tipo de observación es la mas adecuada para muestras teñidas o con pigmentos naturales y que resultan altamente contrastadas. 

Es muy utilizada en patología e histología vegetal y animal, para la observación de cortes finos de tejidos, sonde bajo un fondo brillante aparece la muestra contrastada. En cambio no es demasiado útil para la observación de células vivas.

La técnica de observación a campo oscuro es una técnica de contraste, sin luz directa, dónde solo la luz difractada desde el espécimen se usa para formar la imagen. 

En esta técnica, las muestras deben ser transparentes y no presentar tinción. Se debe controlar la luz de la muestra, para que la luz central se bloquee. La iluminación (gracias al condensador) forma un cono hueco, solo con luz de forma oblicua, la cual refleja en la muestra y alrededores.  La imagen se forma con los rayos de luz dispersados por la muestra y platina, que son capturados por el objetivo. 

Es una técnica adecuada para la observación de células y organismos vivos. Esto es así , porque el contraste se crea por un organismo brillante sobre fondo oscuro, así revelamos fondos, bordes y contornos del organismo. Uno de los usos principales es en hematológia, sobre células de sangre vivas. 

La técnica de contraste de fases, también corresponde a una técnica de observación por contraste, valga la redundancia. Eso quiere decir que el resultado de la imagen sera el fruto del paso de la luz a través de la muestra, normalmente viva, y los diferentes índices de refracción que resulten de esto. 

La luz desde una lámpara/bombilla de halógeno-tungsteno es dirigida a través de un lente colectora y enfocada hacia anillos especializados del condensador. Los frentes de onda pasando a través del anillo iluminan al espécimen y pasan directamente ( o difractados) a través de la muestra y son retardados por los gradientes de fase de la muestra. La luz sin desviar, difractada y colectada por el objetivo es separada por un plato de fases y enfocada en el plano intermedio de la imagen para formar la imagen final. 

Esta técnica se usa en observación de células vivas o en estudio de materiales con láminas muy finas. 

El microscopio de fluorescencia se basa en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la radiación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Es decir, se han excitado.  Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo.

Así podríamos determinar esta técnica de observación como indirecta, ya que la observación o resultado es gracias a la reacción de determinadas moléculas o células sobre un primer tipo de luz o radiación que han absorbido. 

La microscopia de fluorescencia se utiliza para detectar sustancias determinadas como la vitamina A o sustancias marcadas con fluorocromos. Además permite determinar la distribución de una sola especie de molécula, su cantidad y ubicación en el interior de la célula. Es una técnica muy específica y evolucionada, pero a la vez muy utilizada en el análisis biomolecular.